BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功

日期: 2019-08-05
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81日,BD公司钟星宇博士、许义松博士莅临序科码,指导Rhapsody多样品标记单细胞全转录组测序建库。此次实验共标记4个样品,上样4万个细胞。经过两天的辛勤实验,建库工作顺利完成,质检合格。这也标志着继10X Genomics、单细胞甲基化、单细胞CNV、单细胞ATAC-seq等之后,序科码单细胞阵营再添一员猛将!诺禾致源王忍、雷英彤、黄潇、林绍祥、李航宇,序科码张裕龙、李爽、龙钰垚、谢彩玲、双佩婷、李汶欣、林献威、刘智盛全程参与了实验。


BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功


BD Rhapsody

多样品标记单细胞全转录组测序建库可分为以下几个步骤:(1)样品标记;(2)单细胞分离、细胞裂解、mRNA及样品标签捕获;(3)逆转录、全转录组建库和样品标签建库。

BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功

 

1、样品标记

BD Rhapsody通过抗体连接一段带有poly Asamlple tag 单链DNA序列,将样品进行抗体孵育,wash 2-3次(降低背景噪音),随后带poly A的标签和mRNA一起被带有Poly T的磁珠捕获,可最多区分12个样品。


BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功

 

2、单细胞分离、细胞裂解、mRNA及样品标签捕获

Rhapsody利用微孔进行单细胞分离,属于Microwell-seq。超过20万个微孔的尺寸被设计成一个微孔恰好可以容纳一个bead(磁珠),bead上连接逆转录引物,引物主要包括以下三个部分:

1CLcell label,细胞标签),一个磁珠上的引物CL序列相同,不同磁珠上的引物CL序列不同,从而达到区分细胞的作用;

2UMIunique molecular identifier),一个磁珠上的引物UMI各不相同,可以区分最初的mRNA,去除扩增带来的偏差;

3poly dT,和mRNA及样品标签的poly A互补配对。

当微孔捕获到单细胞和磁珠以后,使用细胞裂解液,细胞裂解释放出mRNA,经孵育以后mRNApoly A和磁珠上的poly T互补配对。最后使用磁铁回收磁珠,进行下一步的逆转录。


BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功

 


3、逆转录、全转录组建库和样品标签建库

回收磁珠以后进行逆转录,通过cDNA合成引入UMICell Label,同一细胞来源的所有mRNA分子都被标记上相同的CL,同一细胞来源的不同mRNA分子都被标记上不同的UMI。由于逆转录酶同时具有DNA聚合酶活性,样品标签形成双链DNA并带上和细胞相同的CL。后续可以分开进行全转录组建库和样品标签建库。


BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功

BD Rhapsody 多样品标记单细胞全转录组测序建库成功




笔者 张裕龙

广州序科码



广州序科码致力于单细胞测序,美国科学院资深院士Dr.Sherman Weissman担任序科码首席科学顾问。公司现有单细胞 RNA 测序、单细胞ATAC-seq、单细胞CNV检测、单细胞甲基化测序、植入前胚胎基因检测、健康相关基因检测和测序数据的生物信息分析等七大服务平台。在单细胞测序方面提供从组织处理、建库、测序、到生信分析一条龙科研服务(广州序科码生物技术有限责任公司,www.SequMed.com)。 


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