类别说明

技术背景:

       单细胞DNA水平的测序是一项基于单个细胞水平上采取高质量的全基因组扩增与测序相结合的技术,用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。该技术目前主要应用于肿瘤发生机制及胚胎发育研究,两种均存在体细胞突变 (点突变或拷贝数突变)。由于肿瘤细胞之间具有异质性,采用该项技术不需培养细胞,可最真实的获得单克隆癌细胞的具体突变来源及精准的突变频率,以及区分癌症发生、发展、演化过程中的主动与被动突变等。


技术种类:


MDA

单细胞全基因组扩增目前应用最广泛的是重置换扩增(MDA)测序技术,2001年由Laskin团队(包括潘星华)在耶鲁大学两位院士Dr. Sherman Weissman施尔曼. 魏斯曼

和Dr. David Ward, 戴维.伍德创办的分子平台公司(Molecular Staging Inc., 简称MSI)发明的,在2004年实现商业化(试剂名REPLIg),并被著名Qiagen抢购合并。REPLIg使用随机的六聚体引物和DNA聚合酶进行反应,该聚合酶具有很强的链置换特性,能够在等温的条件下,扩增产生50~100kb的DNA片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性,具有很高的复制保真性,并且有效降低扩增偏向性和随机性。扩增之后,通过对扩增产物的质控,进入下游的外显子或者全基因组建库测序和信息分析。REPLIg最初为微量DNA扩增而创建,潘星华等人其后对REPLIg试剂进行了以系列的改进,使之适合于单细胞扩增测序。

 

MDA法比DOP-PCR拥有更高的基因组覆盖度;φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性,使得MDA法在对SNV的分析,以及构建大片段文库上有着显著优势。但是,和DOP-PCR相同,MDA法依然是指数扩增,因此依然存在PCR反应的序列偏好性;然而,和DOP-PCR不同的是,这种偏好性并不重复,因而并不产生序列缺失,因此MDA法的基因组覆盖度远比DOP-PCR高,但是还具有明显的扩增拷贝数的偏差;MDA除分析SNV之外仍然适合进行CNV的分析,但是需要专门的分析软件。

 

MALBAC

       2012年由谢晓亮团队发明,拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp的共同序列,3’是8bp的随机序列,可以和模板在15~20℃的低温下结合,经过8~12个循环的拟线性扩增后,再对这些环状的扩增子进行指数扩增。应用范围:MALBAC法的优势在于,虽然它依然存在一定的序列偏好性,但和MDA不同,MALBAC的这种偏好性在不同的细胞之间是可重复的,因此可以通过对参考细胞标准化后,进行CNV的分析;另外,由于其扩增的均一性,MALBAC法扩增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱点在于,它使用的聚合酶保真性不如MDA,因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性;另外,由于它可重复性的序列偏好性,基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失。



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